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动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定的前处理方法

点击次数:172  发布时间:2020-08-17

氯霉素类药物的危害及检测目的

 

氯霉素类药物主要包括氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素,又称为酰胺醇类,属于广谱抗生素,对革兰氏阳性菌和阴性菌均有抑制作用。由于氯霉素合成容易价格低,治疗食品动物传染性疾病效果较好,所以有在养殖过程中使用氯霉素的违法行为,从而造成动物源性食品中氯霉素残留。研究证明氯霉素可引发人体造血系统疾病,产生细菌耐药性等危害。2020年我国农业农村部公告第250号,将氯霉素及其盐、酯列入《食品动物中禁止使用的药品及其他化合物清单》中。

   本文阐述了如何将氯霉素类药物从样品基质中分离提取出来,并经过净化后,转化成液质联用仪可以检测的形式。以提取、净化为重点,依据国标GB/T 22338-2008,为检测人员和相关领域研究人员提供一定的参考。

 

检测项目:氯霉素类药物

应用范围:动物源性食品/水产品//畜禽产品/畜禽副产品

液相色谱-质谱/质谱法

方法原理:针对不同动物源性食品中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素残留,分别采用乙腈、乙酸乙酯-乙醚或乙酸乙酯提取,提取液用固相萃取柱进行净化,液相色谱-质谱/质谱仪测定,氯霉素采用内标法定量,甲砜霉素和氟甲砜霉素采用外标法定量。

前处理仪器:

高速组织捣碎机;均质器;旋转蒸发仪;分析天平;移液枪(200 μL 和1 mL);心形瓶(100 mL棕色);分液漏斗(200 mL);聚四氟乙烯离心管(50 mL);离心机;涡旋混合器;固相萃取装置。

检测仪器:LC-MS/MS+ESI

试样制备

从原始样品中取出部分有代表性样品,经高速组织捣碎机均匀捣碎或混匀,用四分法缩分出适量试样,均分成两份,装入清洁容器内,加封后作出标记,一份作为试样,一份作为留样,于-20 条件下保存。

 


前处理方法

1.提取

动物组织(肝、肾除外)与水产品

称取试样5 g(精确至0.01 g),置于50 mL离心管中,加入100 μL氯霉素氘代内标(氯霉素-D0.1μg/mL)工作溶液和30 mL乙腈,匀浆,离心5 min。将上清液移入250 mL分液漏斗中,加15 mL乙腈饱和的正己烷,振荡5 min,静置分层,转移乙腈层至100 mL棕色心形瓶中。残渣中再加入30 mL乙腈,振摇3 min,离心5 min,取上清液转移至同一分液漏斗,振荡5 min,静置分层,转移乙腈层至同一棕色心形瓶中。向心形瓶中加入5 mL正丙醇,于40 ℃水浴中旋转蒸发近干,用氮气吹干,加5 mL丙酮-正己烷(1+9)溶解残渣。

 

动物肝、肾组织

称取试样5 g(精确至0.01 g),置于50 mL离心管中,加入30 mL乙酸钠缓冲液(0.1 mol/L pH 5.0),均质2 min,加入300 μL β-葡萄糖醛酸苷酶,于37 ℃温育过夜。消解样品中加入100 μL氯霉素氘代内标(氯霉素-D0.1 μg/mL)工作溶液,20 mL乙酸乙酯-乙醚(75+25),振摇2 min,离心5 min。取上层有机层入心形瓶中,在40 ℃水浴中旋转蒸发近干,用氮气吹干,加5 mL丙酮-正己烷(1+9)溶解残渣。

 

蜂蜜

称取蜂蜜试样5 g(精确至0.01 g),置于50 mL离心管中,加入100 μL氯霉素氘代内标(氯霉素-D0.1μg/mL)工作溶液,5 mL水,混匀,再加入20 mL乙酸乙酯,振摇2 min,离心5 min,移取有机层到100 mL棕色心形瓶中,于离心管中再加入20 mL乙酸乙酯,振摇2 min,离心5 min,合并有机层于棕色心形瓶中,40 ℃水浴中旋转蒸发至干,3 mL水溶解残渣,混匀。

 

2.净化

动物组织与水产品

用5 mL丙酮-正己烷(1+9)淋洗LC-Si硅胶小柱,弃去淋洗液,将残渣溶解溶液转移到固相萃取小柱上,弃去流出液,用5 mL丙酮-正己烷(6+4)洗脱,收集洗脱液于心形瓶中, 40 ℃水浴中旋转蒸发至近干,氮气吹干,用1 mL水定容,定容液过0.45 μm滤膜至进样瓶,待测定。

 

蜂蜜

分别用5 mL甲醇,5 mL水活化EN固相萃取柱,将提取液转移上柱,用5 mL水淋洗,用玻璃棒压干1 min,用3 mL乙酸乙酯洗脱,洗脱液用氮气吹干,用1 mL水定容,定容液过0.45 μm滤膜至进样瓶,待测定。

 

国标解读及注意事项

1.氯霉素类标准物质用乙腈配成500 μg/mL标准储备液在4 ℃避光条件下保存可以使用6个月。

2.不同的基质使用不同的提取和净化方法,注意内脏组织需要酶解,β-葡萄糖醛酸苷酶只能冷藏,不能冷冻保存,否则会失活。

3.用水定容后,采用涡旋加超声方式复溶,可以提高复溶效果。

4.由于质谱检测过程中扫描方式为负离子扫描(ESI-),建议专门使用一台液质仪,只进行负离子扫描的检测,保证检测灵敏度。

5.可以在前处理过程中加入甲砜霉素和氟甲砜霉素相对应的同位素内标物质,校正回收率。

 

参考文献:GB/T 22338-2008 动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定

 

 

动物组织(肝、肾除外)与水产品中氯霉素类药物残留量测定的前处理流程图

 

动物肝、肾组织中氯霉素类药物残留量测定的前处理流程图

蜂蜜中氯霉素类药物残留量测定的前处理流程图

*氯霉素类药物信息表

坛墨质检对应相关标物

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